Analýza spermií

-          Voľne bežiaca elektorforéza – rozdielne povrchové elektrické náboje medzi spermiami nositeľmi X a Y – chromozómu.

-          Technika tenkovrstvovej distribúcie – detegovanie malých rozdielov v charakteristickách bunkového povrchu podľa množstva molekúl s chýbajúcim elektrickým nábojom.

-          Imunologická detekcia – princíp existencie špecifického samčieho antigénu, H-Y antigénu, ktorý možno lokalizovať použitím monoklonálnych H-Y protilátok.

-          Albumínová separácia spermií – predpokladá sa že Y – spermie sa ponárajú do tekutiny s vysokou hustotou a viskozitou (modifikovaný Tyrodov roztok s vysokou koncentráciou bovinného sérového albumínu – BSA) rýchlejšie v porovnaní s X –spermiami.

-          Fluorescenčná analýza – pre kontrolu separácie spermií v klinickej humánnej praxi sa najdlhšie používa technika farbenia quinacrinom – farbivom, ktoré deteguje fluorescenčné teliesko Y-FISH metóda (Flurescenčná in situ hybridizácia).

-          V prípade analýz častí embrya existujú nasledovné spôsoby:

o    detekcia chromozómu Y

§  Prvou metódou bolo stanovenie pohlavia prostredníctvom karyotypu

§  Druhým spôsobom je využitie sondy špecifickej pre chromozóm Y, ktorá sa musí pevne viazať iba na chromozóm Y a musí byť ľahko detekovateľná

o    detekcia H-Y antigénu –

§  Je založená opäť na prítomnosti alebo neprítomnosti chromozómu Y

§  Analýze prechádza získavanie protilátky, kde sa samičke aplikuje antigén H-Y a jej imunitný systém vyprodukuje k nemu protilátky.

§  Detekcia týchto protilátok sa uskutočňuje podľa ich väzby so špecifickým fluorescenčným farbivom s využitím fluorescenčného mikroskopu s filtrom pre určitú vlnovú dĺžkou.

o    Bisekcia

§  Rozrezanie embrya  vo vyššom vývojovom štádiu na dve polovice

§  Jedna časť embrya pokračuje vo vývoji v médiu a druhá je použitá na analýzu pomocou PCR reakcie. PCR metóda je založená na selektívnej amplifikácii sledovaného úseku DNA v podmienkach in vitro za použitia špecifických primerov. Primery vymedzujú amplifikovaný úsek DNA, ktorý je homológny s chromozómom Y (samček).

§  V prípade samčieho pohlavia detegujeme PCR produkt – amplifikovaný úsek chromozómu Y u samičieho pohlavia nedetegujeme žiadny PCR produkt.

o    mikroaspirácia  jednej blastoméry a PEP – PCR.

§  Z embrya je pomocou špecifických mikromanipulačných jednotiek vybraná len jednu blastoméra. Analyzované embryo tak bez jednej blastoméry pokračuje vo vývoji v in vitro podmienkach, PEP – PCR metódou z izolovanej blastoméry pomocou náhodných primerov namnožíme väčší počet kópií úsekov DNA. Tento PEP-DNA templát nám potom umožňuje využiť klasickú PCR metódu.

Zmrazovanie embryí a spermií

-          Dôležitou technikou dlhodobého uchovávania embryí a spermií je ich zmrazovanie (kryouchovávanie).

-          Umožňuje vytváranie bánk inseminačných dávok a embryí  aj z kvalitnejšieho genetického materiálu.

-          Opodstatnenie zmrazovania embryí a spermií je aj v zachovaní génových rezerv najmú ak sa jedná o plemená, ktorým hrozí vyhynutie.

-          Základom kryouchovávania cicavčích embryí je zníženie miery poškodenia vplyvom intracelulárnej tvorby ľadu.

-          Vyvinuté boli dve základné techniky:

o    pomalé kryouchovávanie

o    rýchle zmrazovanie (vitrifikácia)

-          Kryouchovávanie biologického materiálu zahŕňa šesť krokov: prvotné kryoprotektívum, ochladenie (rýchle, pomalé) pod bod mrazu, uskladnenie v tekutom dusíku pri 196°C, rozmrazenie, zriedenie a vyplavenie kryoprotektíva a prenesenie biologického materiálu do fyziologických podmienok.

-          Kryouchovávanie spermií je možné realizovať dvoma spôsobmi  do pejet  a zmrazovanie  do peliet.

-          Problémom – nízka motilita a prežívateľnosť spermií po rozmrazení.

-          Dôležitá podmienka: vytvorenie takého prostredia pre smermi, ktoré sa najviac približuje prirodzeným podmienkam vytvoreným semennou plazmou – potrebné riedidlá.